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BIOLOGIE DU DÉVELOPPEMENT

LE FIBROBLASTE : UN EXEMPLE DE CAPACITES D’ADAPTATIONS TEMPORELLES ET LOCO-REGIONALES

Comme la cellule mésenchymateuse dont il est dérivé, le fibroblaste préserve au delà du stade foetal, une grande plasticité fonctionnelle.
Nous ne fournirons que quelques points clefs des propriétés du fibroblaste, en envisageant:
   - En premiere partie : les capacités d’expression phénotypique de cette cellule, en insistant sur les processus de sénescence, et les mécanismes cytologiques et moléculaires associés.
   - En deuxième partie : les mécanismes de synthèse-sécrétion, et la régulation de certains processus de prolifération/différenciation au travers des interactions cellule/matrice
I - LE FIBROBLASTE : UN EXEMPLE DE COMPREHENSION DES MECANISMES DE SENESCENCE
I-1 FIBROBLASTE ET MECANISMES DE SENESCENCE : LA THEORIE DE HAYFLICK

I-2 FIBROBLASTE ET THEORIE DE HAYFLICK : SENESCENCE, TRANSFORMATION ET CANCER

I-3 COMPLEMENTS SUR TELOMERES ET TELOMERASE

II - LE FIBROBLASTE : INTERACTIONS MATRICIELLES

II-1 LE FIBROBLASTE : SYNTHESE DES MOLÉCULES MATRICIELLES
II-1-1 FIBROBLASTE ET LA SYNTHESE DES PROTEINES MATRICIELLES : LES 4 GRANDES CLASSES

II-1-2 LE FIBROBLASTE ET LA SYNTHESE DES PROTEINES MATRICIELLES : LES COLLAGENE

II-1-3 FIBROBLASTE ET LA SYNTHESE DES PROTEINES MATRICIELLES : LES FIBRES ELASTIQUES

II-1-4 FIBROBLASTE : LA SYNTHESE DES GLYCOSAMINO-GLYCANES ET PROTEOGLYCANES

II-1-5 FIBROBLASTE ET LA SYNTHESE DES MOLECULES D'ADHESION

II-1-6 MOLECULES D'ADHESION ET RECEPTEURS CELLULAIRES : LES INTEGRINES

II-2 LES LAMES BASALES : UN MODELE EXEMPLAIRE DES INTERACTIONS CELLULES-MATRICE

II-3 LES INTERACTIONS ENTRE CELLULES ET MATRICE : schéma récapitulatif

 

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I - LE FIBROBLASTE : UN EXEMPLE DE COMPREHENSION DES MECANISMES DE SENESCENCE


Le fibroblaste est une des premières cellules de mammifère non transformée, non cancéreuse, qu’on a su cultiver in vitro, en particulier en utilisant des cellules d’animal nouveau né.

On doit à Hayflick (1961) d’avoir mis en évidence le mécanisme de sénescence in-vitro (souvent désigné par théorie de Hayflick).
En résumé :

- Le fibroblaste cultivé in vitro ne peut se diviser qu'un nombre limité de fois. Au delà, les cellules subissent une "crise" qui les empèche d'entrer dans le cycle mitotique (sénescence = phase G0 définitive). Les fibroblastes meurent ensuite rapidement. Certaines cellules "échappent" à la crise : il s'agit de fibroblastes qui subissent une transformation.

- La crise et la sénescence s'accompagnent de modifications oncogéniques. Ces variations permettent aussi de mieux comprendre les interrelations vieillissement/cancer

- La sénescence est associée à un mécanisme de réduction télomérique

- La sénescence in vitro peut expliquer en partie le vieillissement in-vivo : le nombre de cycles cellulaires d'un fibroblaste en culture diminue avec l'âge du donneur. Ce nombre de cycle est moindre dans les maladies où on observe un vieillissement précoce.


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I-1 FIBROBLASTE ET MECANISMES DE SENESCENCE : LA THEORIE DE HAYFLICK


Il est facile de faire proliférer des fibroblastes humains (ou ceux d’autres espèces) in vitro dans des boites de culture en utilisant des conditions nutritionnelles et d’oxygénation précises. Il est alors possible d’effectuer des “passages” successifs : lorsque les cellules ensemencées ont occupé la totalité du fond de la boite par multiplication mitotique, il suffit de “repiquer” quelques cellules pour obtenir un nouveau “passage” et de nouvelles mitoses. Et ainsi de suite.
Pour un passage donné, s’il s’agit de cellules normales ou embryonnaires, le nombre des mitoses reste limité. En effet, lorsque les cellules atteignent la confluence et forment un tapis continu au fond de la boite, le mécanisme d’inhibition de contact stoppe l’entrée des fibroblastes dans le cycle réplicatif (voir le cours d’embryologie causale : cycle cellulaire et passage en G0).





La théorie de Hayflick nous apprend que:

q le nombre des passages est limité pour un fibroblaste normal :

- environ 65 passages chez l’homme
- soit environ 180 à 200 mitoses successives

q le nombre de passage varie selon les espèces (35-40 chez le rat)

q les fibroblastes subissent une crise, au delà de laquelle,

- presque tous les fibroblastes entrent en sénescence,
- ne peuvent plus proliférer,
- et finissent par mourir (beaucoup par apoptose)


q certains fibroblastes n’entrent pas en sénescence, mais se transforment et s’immortalisentq le phénomène de sénescence existe aussi in-vivo, puisque :

- le nombre de passages en culture diminue avec l’âge du donneur
- le nombre de passages est beaucoup plus faible pour des fibroblastes prélevés sur des patients atteints de maladies provoquant une sénilité précoce (environ 45 passages chez les mongoliens, moins de 40 pour la Progéria)

q le processus est ubiquitaire et se retrouve pour bien d’autres cellules (lymphocytes, kératinocytes de la peau, etc)



La théorie de Hayflick nous apprend aussi que:

q les fibroblastes en culture n’ont pas une évolution univoque et ne sont pas tous similaires :
- il existe au moins 7 phénotypes différents de fibroblastes, traduisant une hétérogéneïté fonctionnelle (propor-tions variables des organites, morphologies différentes)
- ces phénotypes évoluent de façon différentielle au cours des passages successifs. Après la crise apparaissent des phénotypes d’allure fibrocytique, tous post-mitotiques, c’est à dire des fibroblastes devenus incapables d’atteindre le point Start (voir cours d’embryologie). Il s’agit des phénotypes sénescents.
q  les conditions environnementales (qualité nutritionnelle du milieu de culture, stress pharmacologique unique ou itératif, etc) modifient l’expression et le pourcentage relatif des différents phénotypes : non seulement pour le passage en cours mais aussi pour les passages ultérieurs.

q les capacités adaptatives du fibroblaste à l’environnement diminuent au cours des passages successifs. Les phénotypes sénescents ne s’adaptent plus
.




Plusieurs mécanismes biologiques expliquent les observations de Hayflick (et écoles associées) :
q Les processus de sénescence s’accompagnent de modifications des cascades oncogéniques. Il est impossible de décrire la multitude des modifications.

La crise représente un état transitionnel (plus ou moins progressif) qui s’accompagne de changements majeurs d’activité. Le schéma ci-contre fournit un exemple pour des oncogènes déjà étudiés et dont nous connaissons les propriétés (voir embryologie moléculaire). Par rapport à la GAPDH (gène de ménage dont l’expression reste constante), les variations observées permettent d’expliquer :
1) l’impossibilité progressive des cellules à proliférer avec entrée obligée en G0 et non franchissement du point Start (chûte de jun/fos, inversion d’expression des cyclines E et D)
2) Une moindre capacité pour réparer le DNA et un risque plus grand de mutagénèse somatique (chûte de la P53)
3) un risque simultané de transformation et/ou cancérisation (chûte de P53, surexpression constitutive de myc et ras).

q Certains auteurs ont établi à partir de données similaires un concept thermodynamique du vieillissement.
Ils démontrent que tout système biologique subit des dégradations contre lesquelles les cellules luttent (organisation) en se stabilisant à un niveau d’energie libre minimal. Lorsque le système ne peut plus être suffisamment coordiné, il passe brutalement à un niveau d’énergie inférieur (situation transitionnelle obéissant à la théorie fractale et des catastrophes). De cascade en cascade, la cellule aboutit à un niveau énergétique non compatible avec l’organisation de la vie, et donc à la mort (programmée ou non)




q LA REDUCTION TELOMERIQUE (voir aussi en fin de cette lecture) est un autre caractéristique du vieillissement cellulaire et de la sénescence.

Le schéma ci-contre montre l’évolution des télomères sur des cellules fibroblastiques, sachant que l’hypothèse télomérique du vieillissement a été vérifiée sur de très nombreux modèles cellulaires, autres que le fibroblaste.

Les courbes appellent les commentaires suivants :

1 - au cours des cycles replicatifs successifs l’expression de la télomérase diminue progressivement et les télomères sont de plus en plus courts.

La réduction télomérique est finalement incompatible avec la poursuite d’une viabilité cellulaire normale, eu égard aux multiples rôles des télomères.
2 - A contrario les quelques fibroblastes qui persistent après la crise sont des cellules transformées. On assiste alors à une reexpression de la télomérase. L’expression permanente (constitutive) de la télomérase semble bien être une propriété intrinsèque des cellules immortalisées et/ou des lignées cancéreuses .

 



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I-2 FIBROBLASTE ET THEORIE DE HAYFLICK : SENESCENCE, TRANSFORMATION ET CANCER

 

Nous avons montré en embryologie causale que le développement normal est soumis à un contrôle rigoureux et très complexe. Nous avons abordé le concept de cascade oncogénique dont les facteurs sont (vision grossière), stimulants ou au contraire inhibiteur de prolifération.

Tout dysfonctionnement oncogénique, lié à un accident génomique alléatoire, risque alors d’aboutir à un cancer, c’est à dire

- à des cellules ayant une prolifération/différenciation anormalement contrôlée
- à des cellules capables d’envahir et coloniser d’autres tissus.

Les transformations oncogéniques impliquées dans la cancérisation sont au moins de 2 types :

- protooncogène stimulateur -> oncogène en permanence hyperactif ; l’hétérozygotie est suffisante pour l’expression tumorale.
- gène supresseur de tumeur (protoantioncogène) -> gène supresseur de tumeur désactivé ; l’homozygotie est nécessaire pour l’expression.

En simplifiant à l’extrême, le mécanisme de transformation résulte de 2 possibilités :

- une mutagénèse somatique spontanée de la cellule, consécutive à des aggressions diverses (radiations ionisantes, radicaux libres, agents pharmacotoxiques, etc)
- une mutagénèse liée à des rétrovirus transformants :
- que le retrovirus apporte un oncogène muté dans la cellule hôte qui devient cancéreuse
- ou que le rétrovirus apporte, par insertion génomique en position efficace, un promoteur fort d’hyperexpression pour un protooncogène naturel déjà présent dans la cellule.

Les premiers retrovirus ont été découverts dans des tumeurs du tissu conjonctif transformant les cellules fibroblastiques (sarcome de Rous)
Par ailleurs, un des tests classiques de la nature transformante d’un virus reste le test de transformation des fibroblastes en culture cellulaire


LES GRANDS CARACTERES OBJECTIFS DE TRANSFORMATION DES FIBROBLASTES

TESTS DE PROLIFERATION :

DISPARITION DE L'INHIBITION DE CONTACT : les cellules finissent par "se chevaucher" sur le support du fond de la boîte de culture
IMMORTALISATION : ... par opposition à la théorie de Hayflick
INSENSIBILITE RELATIVE AUX FACTEURS DE CROISSANCE
FORMENT DES TUMEURS APRES IMPLANTATION SUR LA SOURIS "NUDE" (immunodéprimée)

TESTS D'ADHESIVITE :

PERTE D'ADHERENCE AU SUPPORT ET DEFICIT D'ANCRAGE : les cellules n'ont plus besoin de support ; elles poussent aisément en milieu liquide ou semi-liquide (sur agar mou)
SYNTHESE DE FIBRONECTINE DIMINUEE
AUGMENTATION DE SYNTHESE DES PROTEASES DIRIGEES CONTRE LA MATRICE

TEST MORPHOFONCTIONNELS :

MODIFICATION DE LA FLUIDITE MEMBRANAIRE ; EPAISSISSEMENT DU CELL COAT
DIVERSES MODIFICATIONS DE L'EXPRESSION DES PROTEINES,
particulièrement des protéines de la membrane plasmique (récepteurs, transporteurs, molécules d'adhésion, etc) et celles impliquées dans les cascades oncogéniques.

>>> CES CARACTERES SONT GENERALISABLES A LA PLUPART DES AUTRES CELLULES CANCEREUSES


  Les étapes sont longues pour développer un cancer : cumul obligé de plusieurs mutations pour initier le cancer, puis potentialisations des viciations cellulaires pour le promouvoir. On a pu démontrer qu’il était peu probable qu’un cancer puisse être objectivé (pro-gression et métastases) en moins de 5 ans.

  La désadaptation et le défaut d’homéostasie caractéristiques du vieillissement sont aussi des phénomènes lents et progressifs, dont le modèle de Hayflick ne fournit probablement qu’une modélisation partielle et accélérée.
  Mais le modèle de Hayflick permet cependant de mieux comprendre les liens possibles entre vieillissement et cancer. Le tableau ci-dessus répertorie un ensemble de mécanismes communs. Dans les deux cas, la plus ou moins grande fragilité génétique, et un cumul d’erreurs liées à l’environnement sont impliqués.

  La prévalence du cancer avec l’âge ne sera plus surprenante pour nous.



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I-3 COMPLEMENTS SUR TELOMERES ET TELOMERASE


  Les télomères correspondent à des fragments d’ADN hautement répétitif et non codant aux extrémités des chromosomes linéaires eucaryotiques
Il s’agit de courtes répétitions en tandem de séquences riches en G sur le brin d’ADN 3’ terminus (l’anti-brin 5’ est donc riche en C). Les séquences sont caractéristiques d’une espèce donnée (homme : [GGGTTA]n ou n est un nombre variable et non équilibré entre brin 3’ et brin 5’).
Les télomères sont synthétisés par une nucléoprotéine enzymatique, la télomérase.

L’ADN télomérique, au même titre que d’autres séquences non codantes (en particulier l’ADN centromérique et l’ADN des points Origine de réplication), est nécessaire au fonctionnement de plusieurs étapes du cycle cellulaire.
Les télomères ont en effet au moins 4 rôles principaux (il y en a d’autres) :

- ils protègent les zones codantes du chromosome du risque de destruction hydrolasique par les exonucléases nucléaires.
- ils sont nécessaires à la régulation du niveau de condensation de la chromatine par interaction avec la membrane nucléaire au cours de l’intercinèse,
- ils sont responsables (mécanisme mal connu) du gradient d’extinction génique centromère-télomère, sachant que les gènes de l’extrémité ne sont que peu ou pas exprimés lorsque les télomères sont de longueur normale
- surtout, les télomères sont nécessaires pour l’achèvement de la replication en phase S, en particulier pour permettre à l’ADN-polymérase (en particulier delta) de synthétiser le terminus du brin retardé.

Le mécanisme de synthèse télomérique est complexe. Nous ne reportons ici que les données essentielles, renvoyant l’étudiant à la lecture de la biologie cellulaire ou à celle d’un ouvrage de biologie moléculaire.

Sans ce mécanisme les chromosomes linéaires d’eucaryotes ne pourraient être totalement repliqués. De l’information serait perdue à chaque cycle.
En effet nous savons que la replication semiconservative par l’ADN polymérases (a ou d) nécessite une amorce 5’ pour initier la replication. Ce besoin empêche la replication complète de l’extrémité 3’ du brin chromosomique ; il est connu sous le terme du “end replication problem”. En l’absence de mécanisme compensatoire, il y aurait une perte progressive d’ADN à l’extrémité chromosomique (d’autant plus que des brins monocatenaires non repliqués deviennent instables).

L’addition par la télomérase de séquences non codantes permet de pallier le défaut de replication de séquences codantes aux extrémités du chromosome, donc pallier un risque de perte d’information génétique. Le processus est décrit dans la page suivante.



Le mécanisme de synthèse effectué par la télomérase est complexe.

La zone télomérique forme des repliements pseudo-bicatenaires en épingle à cheveux sur le brin précoce riche en G (grace à des appariements illicites G-G). Cette structure bicaténaire sert de substrat à la télomérase, qui déplie alors les épingles à cheveux et ajoute des séquences télomériques.
Ce mécanisme est rendu possible par la présence d’une courte séquence d’ARN constitutive à la télomérase qui est donc bien une nucléoprotéine (avec sa matrice d’ARN intra-moléculaire).
La séquence d’ARN (chez l’homme séquence d’ARN CCCTUU) sert de matrice pour synthétiser des séquences riches en G sur le brin précoce.




L’allongement à l’extrémité 3’ ayant été effectué au terminus du brin précoce par la télomérase, l’ADN polymérase (principalement delta ) peut alors effectuer la synthèse terminale du brin tardif dans le sens obligé 5’>3’, comme elle le ferait habituellement pour les autres fragments d’Okasaki.

Sans ce mécanisme les chromosomes linéaires d’eucaryotes ne pourraient être totalement repliqués. De l’information serait perdue à chaque cycle (la copie se ferait de plus en plus en aval sur le brin).


ILLUSTRATION DE LA RÉDUCTION TÉLOMÉRIQUE AVEC L’ÂGE SUR DES POPULATIONS DE LYMPHOCYTES HUMAINS

(vous apprendrez ultérieurement dans d’autres cours les différences fonctionnelles existant entre lymphocytes T naif et lymphocytes mémoires)

Représentation schématique des télomères à l'echelle chromosomique et moléculaire
Weng N.P. et al, Immunological rev., 1997, 160, 43-54
NOTA : des protéines associées (TBP) sont nécéssaires à la stabilité et/ou à la préservation de la longueur des télomères. Certaines se lient sur un seul brin, d'autres ont une liason bicatenaire

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RESUME DU MECANISME DE REDUCTION TELOMERIQUE


 

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